1、適用範圍：適用於判定塊狀冷藏與冷凍解凍豬肉。

2、原理：凍結處理會破壞肌肉細胞之粒線體，解凍時粒線體中之酵素會
   釋放至肌漿中，因此測定肌漿中粒線體β-羥基醯輔酶A去氫酶（β-
   hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH）之活性，即可暸解豬肉是否
   經過冷凍處理。

3、儀器設備及藥品
 3.1 試藥
  3.1.1 磷酸氫二鉀（K2HPO4）：試藥級。
  3.1.2 磷酸二氫鉀（KH2PO4）：試藥級。
  3.1.3 Ethylene-dianitrilo-tetra-acetic acid（EDTA）：試藥級。
  3.1.4 還原型菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸（β-NADH Sigma-Aldrich）：
        對照用標準品。
  3.1.5 乙酸乙醯基輔酶A（Acetoacetyl-CoA Sodium，Sigma-Aldrich）
        ：對照用標準品。
 3.2 去離子水：比電阻於25℃可達18ΜΩ.cm以上。
 3.3 儀器設備及器材
  3.3.1 分光光度計：波長340 nm。
  3.3.2 搾肉汁器：2塊厚1.5 cm之壓克力板，搾取肉汁。
  3.3.3 利刃。
  3.3.4 塑膠培養皿。
  3.3.5 漏斗。
  3.3.6 濾紙：Whatman No.2。
  3.3.7 定量瓶：25 mL。
  3.3.8 塑膠試管：5 mL。
  3.3.9 塑膠離心管：50 mL。
  3.3.10石英管：3 mL，1 cm × 1 cm管徑。
 3.4 試劑配製
  3.4.1  0.1 M磷酸緩衝液（pH 5.5）：秤取K2HPO4 17.4 g及KH2PO4 13
         .6 g，分別以蒸餾水溶成1 L後，混合兩種溶液調整至pH 5.5，
         置於4 °C冰箱備用。
  3.4.2  26.9 mM EDTA溶液：100mg EDTA溶於10 mL蒸餾水後冷藏備用。
  3.4.3  7.1 mM還原型菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸（β-NADH，SIGMA-
         ALDRICH）溶液：5 mg NADH溶於1 mL蒸餾水冷藏備用。
  3.4.4  5.9 mM乙酸乙醯基輔酶A（Acetoacetyl-CoA Sodium，SIGMA-
         ALDRICH）溶液：5 mg之Acetoacetyl CoA溶於1 mL蒸餾水後冷
         藏備用。

4、操作流程
 4.1 肉汁製備
  4.1.1  冷凍塊狀豬肉於試驗前48小時取出置於4°C冷藏櫃中解凍，以利
         刃取下約2-3 g肉（1.5 × 1.5 cm），切口表面以0.1 M磷酸緩
         衝液沖洗，再以紙巾擦乾表面。
  4.1.2  將肉放在兩塊厚約1.5 cm之壓克力板間，旋緊螺絲以搾取肉汁
         ，並以塑膠培養皿收集肉汁。
  4.1.3  肉汁以0.1 M磷酸緩衝溶液稀釋200倍，並經濾紙（Whatman
         No.2）過濾後備用。
 4.2 酵素活性測定步驟
  4.2.1  取2.6 mL 0.1 M磷酸緩衝溶液加入1 cm × 1 cm管徑之石英管中
         。
  4.2.2  加入0.2 mL 26.9 mM之EDTA溶液。
  4.2.3  加入0.05 mL 7.1 mM之β-NADH溶液。
  4.2.4  加入0.1 mL稀釋200倍之肉汁後混合均勻；對照組加入0.1 mL去
         離子水。
  4.2.5  加入0.05 mL 5.9 mM之Acetoacetyl-CoA，立刻混勻並置入分光
         光度計（Spectrophotometer, SHIMADZU，UV-1800型；Beckman
         Coulter，DU 700），以波長340 nm測定反應0、1、2及3分鐘之
         吸光值（O.D.），扣除對照組之吸光值後，計算每分鐘NADH之
         降解速率（△E/min）。

5、HADH酵素活性之計算
 　Units/mL肉汁＝（△E/min × 3 × 肉汁稀釋倍數）／（6.3 × 0.1）
  △E/min：平均每分鐘吸光值之差值
 　3：石英管中混合液之總體積（mL）
 　6.3：在波長340 nm下β-NADH消失係數
 　0.1：添加稀釋肉汁mL數
 

備註：判定標準以HADH酵素活性5.5 Unit/mL為界，當測值低於5.5
      Unit/mL以下者，可判定樣品為冷藏豬肉；測值高於5.5 Unit/mL以
      上者，可判定豬肉為經過冷凍處理。