1. 適用範圍：本方法適用於寵物食品中致病性大腸桿菌之檢驗。
2. 檢驗方法：檢體經增菌培養後，以選擇性培養基培養，進行定性分析。
2.1 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU/培養皿。
2.2 試藥：氯化鈉、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、結晶紫(crystal violet)、甲基紅(methyl red)、伊紅Y (eosin Y)、亞甲藍(methylene blue)、磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4．4H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4．H2O)、硫酸鎂(MgSO4．7H2O)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7．2H2O)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、葡萄糖(glucose)、核糖醇(adonitol)、纖維雙糖(cellobiose)、阿拉伯糖(arabinose)、甘露糖醇(mannitol)、山梨糖醇(sorbitol)、膽鹽(bile
salts No.3)、中性紅(neutral red)、溴甲酚紫(bromocresol purple)、亞甲藍(methylene blue)、溴瑞香草藍(bromothymol blue)、酚紅(phenol red)、離胺酸(L-lysine)、黏液酸(mucic acid)、無水硫酸鎂(MgSO4)、尿素(urea)、草酸銨、碘化鉀、氰化鉀、碘、沙黃O (safranin O)、對-二甲胺基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde)、α-萘酚(α-naphthol)、氫氧化鉀、肌酸(creatine)、95%乙醇、無水乙醇、戊醇(amyl
alcohol)、異戊醇(isoamyl alcohol)、鹽酸、硝酸鉀(KNO3)、醋酸鈉(CH3COONa) 、液態石蠟、氫氧化鈉、鄰硝基苯吡喃半乳糖(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)、N,N,N',N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylene-diamine dihydrochloride)、對-胺基苯磺酸(sulfanilic acid)、冰醋酸、萘基乙二胺鹽酸鹽〔N-(1-naphthyl) ethylene
diamine dihydrochloride〕、硫酸銨亞鐵〔Fe(NH4)2(SO4)2．6H2O〕、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、聚山梨醇酯80 (polysorbate 80, Tween 80)、硫酸銨〔(NH4)2SO4〕、丙二酸鈉(sodium malonate)及鋅粉均採用化學試藥級；洋菜(agar)、胰化酪蛋白(trypticase)、心肌浸出物(heart muscle infusion)、硫蛋白腖(thiotone)、聚蛋白腖(polypeptone)、酵母抽出物(yeast extract)、牛肉抽出物(beef
extract)、䏡蛋白腖(proteose peptone)、胰化蛋白腖(tryptone)、牛腦浸出物(calf brain infusion)、牛心浸出物(beef heart infusion)及蛋白腖(peptone)均採用微生物級。
2.3 器具及材料
2.3.1 生物安全操作櫃(Biological safety cabinet, BSC)：第二等級(class II)(含)以上者。
2.3.2 乾熱滅菌器：能維持內部溫度在170 ± 10℃者。
2.3.3 高壓滅菌釜：可達121℃以上者。
2.3.4 冰箱：能維持5 ± 3℃者。
2.3.5 顯微鏡：能放大至1000倍之一般光學顯微鏡。
2.3.6 培養箱：能維持內部溫差在± 1℃以內者。
2.3.7 水浴：能維持水溫溫差在± 0.2℃以內者。
2.3.8 攪拌均質器或鐵胃：能適用於無菌操作者。
2.3.9 燈箱：觀察血清試驗用。
2.3.10 天平：可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g；可稱量到100 g者，靈敏度為1 mg。
2.3.11 旋渦混合器。
2.3.12 酸鹼度測定儀。
2.3.13 加熱器。
2.3.14 攪拌器。
2.3.15 吸管輔助器或微量吸管。
2.3.16 吸管：已滅菌。1 mL吸管應有0.01 mL刻度；5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL刻度。
2.3.17 吸管尖：10 μL、20 μL、200 μL及1000 μL。
2.3.18 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.3.19 容器：附螺旋蓋之玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之三角錐瓶、玻璃瓶或廣口瓶，或無菌袋。
2.3.20 杜蘭發酵管(Durham fermentation tube)：外徑9 × 22 mm或其他適用者。
2.3.21 試管：13 × 100 mm、16 × 150 mm或其他適用者。
2.3.22 接種針及接種環(直徑約3 mm)：鎳鉻合金，鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.3.23 載玻片及蓋玻片：適用於染色及鏡檢者。
2.3.24 濾紙及褐色試藥瓶。
2.3.25 蠟筆：塗寫、劃記載玻片時使用。
2.3.26 研缽、杵：研磨試藥用。
2.3.27 無菌濾膜：孔徑0.45 μm或以下之親水性濾膜。
2.3.28 藥勺、剪刀、小刀、鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
2.4 試劑
2.4.1 30%氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉30 g，以蒸餾水溶解使成100 mL。
2.4.2 1.0 M磷酸二氫鈉溶液：取磷酸二氫鈉6.9 g，溶於蒸餾水45 mL，徐徐注入30%氫氧化鈉溶液約3 mL至pH值為7.0，再加蒸餾水使成50 mL，冷藏備用。
2.4.3 鄰硝苯基吡喃半乳糖試劑(ONPG reagent)：取鄰硝苯基吡喃半乳糖80 mL，溶於37℃蒸餾水15 mL，加入1.0 M磷酸二氫鈉溶液5 mL，冷藏備用，使用時須加溫至37℃。
2.4.4 5 N氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉20 g，以蒸餾水溶解使成100 mL。
2.4.5 5 N醋酸溶液：取冰醋酸286 ml，加蒸餾水715 ml。
2.4.6 50%葡萄糖溶液：稱取葡萄糖5 g，溶於蒸餾水10 mL，以無菌濾膜過濾。
2.4.7 0.5%氰化鉀溶液：取氰化鉀0.5 g，溶於冷卻至5～8℃之蒸餾水100 mL。(氰化鉀劇毒，調製時均應冷卻至5～8℃，保存期限以不超過2週為宜。)
2.4.8 柯瓦克氏試劑(Kovacs' reagent)：取對-二甲胺基苯甲醛5 g，溶於戊醇或異戊醇75 mL，再徐徐加入鹽酸，混合均勻後應呈黃色，冷藏備用。
2.4.9 歐普氏試劑(Voges-Proskauer reagent, VP reagents)：
溶液A：取α-萘酚5 g，溶於無水乙醇100 mL。
溶液B：取氫氧化鉀40 g，溶於蒸餾水使成100 mL。
2.4.10 氧化酶試驗試劑(Oxidase test reagent)：取N,N,N',N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽1 g，溶於蒸餾水100 mL，保存於褐色瓶，冷藏備用，使用期限以不超過一星期為宜。
2.4.11 亞硝酸鹽試驗試劑(Nitrite test reagents)：
試劑A：取對-胺基苯磺酸1 g，溶於5 N醋酸溶液125 mL。
試劑B：取萘基乙二胺鹽酸鹽0.25 g，溶於5 N醋酸溶液200 mL。
2.4.12 0.85%生理食鹽水：取氯化鈉8.5 g溶於蒸餾水1000 mL，分裝於容器，經121℃滅菌15分鐘。
2.4.13 甲基紅指示劑(Methyl red indicator)：取甲基紅0.1 g，溶於95%乙醇300 mL，再加蒸餾水使成500 mL。
2.4.14 蛋白腖緩衝液(Buffered peptone water, BPW)：取蛋白腖10 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 3.5 g及磷酸二氫鉀1.5 g，溶於蒸餾水使成1000 mL，分裝於容器，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ± 0.2。
2.5 革蘭氏染色液(Gram stain solution) (註1)
2.5.1 哈克氏(Hucker's)結晶紫液(初染劑)：
溶液A：取結晶紫2 g，溶於95%乙醇20 mL。
溶液B：取草酸銨0.8 g，溶於蒸餾水80 mL。
將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。
2.5.2 革蘭氏碘液(媒染劑)：
取碘化鉀2 g及碘1 g，於研缽研磨5～10秒，加蒸餾水1 mL研磨，次加蒸餾水5 mL研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於蒸餾水，將此溶液注入褐色瓶，再以適量蒸餾水洗滌研缽及杵後，以此洗液併入，使溶液達300 mL。
2.5.3 哈克氏複染液(複染劑)：
取沙黃O 2.5 g，溶於95%乙醇100 mL，供作複染原液。使用時，取原液10 mL，加入蒸餾水90 mL，作為複染液。
註1：革蘭氏染色液因放久可能失效，購買成品時，要注意其保存期限；自行配製者，應檢查其染色效果。
2.6 血清
2.6.1 致病性大腸桿菌多價本體抗血清(Polyvalent "O" type antisera)。
2.6.2 致病性大腸桿菌單價本體抗血清(Monovalent "O" type antisera)。
2.7 培養基
2.7.1 磷酸胰化蛋白腖培養液(Tryptone Phosphate broth，TP)
單倍濃度 雙倍濃度
胰化蛋白腖(tryptone) 20 g 40 g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2 g 4 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2 g 4 g
氯化鈉(NaCl) 5 g 10 g
聚山梨醇酯80(Polysorbate 80) 15 mL 30 mL
蒸餾水 1000 mL 1000 mL
加熱溶解後，分裝於容器，以121°C滅菌15分鐘，最終pH值為 7.0±0.2。
2.7.2 腦心浸出培養液(Brain heart infusion broth, BHI)
牛腦浸出物(calf brain infusion) 200 g
牛心浸出物(beef heart infusion) 250 g
䏡蛋白腖(proteose peptone) 10 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2.5 g
葡萄糖(glucose) 2 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分裝於容器，以121°C滅菌15分鐘，最終pH值為7.4±0.2。
2.7.3 伊紅亞甲藍培養基(Levine's eosin methylene blue agar, L-EMB)
蛋白腖(peptone) 10 g
乳糖(lactose) 10 g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2 g
洋菜(agar) 15 g
伊紅Y (eosin Y) 0.4 g
亞甲藍(methylene blue) 0.065 g
蒸餾水 1000 mL
加熱沸騰溶解後，分裝於容器，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.1±0.2。培養基注入培養皿前，應搖動混合，使絮狀沈澱物分散均勻，搖動時應避免產生氣泡，培養皿約倒入15～20 mL，凝固後打開皿蓋約1/2～1/4，使培養基之表面乾燥。已注入培養皿之培養基宜當天使用，冷藏備用者應於使用前檢查有無雜菌之污染。
2.7.4 馬康奇培養基(MacConkey agar)
䏡蛋白腖(proteose peptone) 3 g
蛋白腖(peptone) 17 g
乳糖(lactose) 10 g
膽鹽(bile salts No.3) 1.5 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
中性紅(neutral red) 0.03 g
結晶紫(crystal violet) 0.001 g
洋菜(agar) 13.5 g
蒸餾水 1000 mL
加熱沸騰溶解後，分裝於容器，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.1±0.2。
2.7.5 血液基礎培養基(blood agar base, BAB)
心肌浸出物(heart muscle infusion) 375 g
硫蛋白腖(thiotone) 10 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
洋菜(agar) 15 g
蒸餾水 1000 mL
加熱沸騰溶解後，分裝於容器，以121℃滅菌20分鐘，最終pH值為7.3 ± 0.2。
2.7.6 三糖鐵培養基(Triple sugar iron agar, TSI)
聚蛋白腖(polypeptone) 20 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
乳糖(lactose) 10 g
蔗糖(sucrose) 10 g
葡萄糖(glucose) 1 g
硫酸銨亞鐵〔Fe(NH4)2(SO4)2．6H2O〕 0.2 g
硫代硫酸鈉(Na2S2O3) 0.2 g
酚紅(phenol red) 0.025 g
洋菜(agar) 13 g
蒸餾水 1000 mL
加熱沸騰溶解後，分取5 mL注入試管，以118℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3±0.2。滅菌後作成斜面培養基，斜面長度約4～5 cm，斜面底部之深度約2～3 cm。
2.7.7 尿素培養液(Urea broth)
尿素(urea) 20 g
酵母抽出物(yeast extract) 0.1 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 9.1 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 9.5 g
酚紅(phenol red) 0.01 g
蒸餾水 1000 mL
溶解後，經無菌濾膜過濾，分取濾液1.5～3 mL，注入已滅菌之試管，最終pH值為6.8±0.2。
2.7.8 溴甲酚紫培養液(Bromocresol purple broth)
蛋白腖(peptone) 10 g
牛肉抽出物(beef extract) 3 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
溴甲酚紫(bromocresol purple) 0.04 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分取約2.5 mL注入裝有發酵管(觀察氣體產生者，如葡萄糖、甘露糖醇、乳糖)之試管，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.0±0.2。冷卻後，各試管分別加入經無菌濾膜過濾之50%葡萄糖溶液278 μL，使培養液中葡萄糖之最終濃度為5% (w/v)。含核糖醇溶液、纖維雙糖溶液、阿拉伯糖溶液、甘露糖醇溶液、乳糖溶液及山梨糖醇溶液之溴甲酚紫培養液配製方法亦同。
2.7.9 胰化蛋白腖培養液(Tryptone broth)
胰化蛋白腖(tryptone) 10 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分取5 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9±0.2。
2.7.10 離胺酸脫羧酶培養液(Lysine decarboxylase broth)
蛋白腖(peptone) 5 g
酵母抽出物(yeast extract) 3 g
葡萄糖(glucose) 1 g
離胺酸(L-lysine) 5 g
溴甲酚紫(bromocresol purple) 0.02 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分取5 ml注入附有螺旋蓋之試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8±0.2。
2.7.11 氰化鉀培養液(Potassium cyanide broth)
基礎培養液
聚蛋白腖(polypeptone) 3 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.225 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 5.64 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，取1000 mL裝於容器，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.6±0.2。以安全吸球吸取0.5%氰化鉀溶液15 ml，加入基礎培養液1000 mL，混合均勻，分取1～1.5 ml注入已滅菌之試管。
2.7.12 MR-VP培養液(MR-VP broth)
蛋白腖緩衝液粉末(buffered peptone-water powder) 7 g
葡萄糖(glucose) 5 g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 5 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分取5 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9±0.2。
2.7.13 柯塞爾氏檸檬酸鹽培養液(Koser's citrate broth)
磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4．4H2O) 1.5 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1 g
硫酸鎂(MgSO4．7H2O) 0.2 g
檸檬酸鈉(Na3C6H5O7．2H2O) 3 g
蒸餾水 1000 mL
溶解後，分取10 mL注入附有螺旋蓋之試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.7±0.2。
2.7.14 醋酸鹽培養基(Acetate agar)
醋酸鈉(CH3COONa) 2 g
氯化鈉(NaCl) 5 g
無水硫酸鎂(MgSO4) 0.2 g
磷酸二氫銨(NH4H2PO4) 1 g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1 g
溴瑞香草藍(bromothymol blue) 0.08 g
洋菜(agar) 20 g
蒸餾水 1000 mL
加熱沸騰溶解後，始加入無水硫酸鎂並混搖均勻。分取8 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.7。滅菌後作成斜面培養基，斜面長度約5 cm。
2.7.15 黏液酸鹽培養液(Mucate broth)
蛋白腖(peptone) 10 g
黏液酸(mucic acid) 10 g
溴瑞香草藍(bromothymol blue) 0.024 g
蒸餾水 1000 mL
蛋白腖加熱溶解後，始加入黏液酸，再徐徐注入5 N氫氧化鈉溶液，攪拌使完全溶解，分取5 mL注入附有螺旋蓋之試管，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.4 ± 0.1。
2.7.16 黏液酸鹽對照培養液(Mucate control broth)
蛋白腖(peptone) 10 g
溴瑞香草藍(bromothymol blue) 0.024 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分取5 mL注入附有螺旋蓋之試管，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.4±0.1。
2.7.17 吲哚亞硝酸鹽培養基(Indole nitrite medium)
胰化酪蛋白(trypticase) 20 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2 g
葡萄糖(glucose) 1 g
硝酸鉀(KNO3) 1 g
洋菜(agar) 1 g
蒸餾水 1000 mL
加熱沸騰溶解後，分取11 mL注入試管，以118℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2±0.2。
2.7.18 丙二酸鹽培養液(Malonate broth)
酵母抽出物(yeast extract) 1 g
硫酸銨〔(NH4)2SO4〕 2 g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.6 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.4 g
氯化鈉(NaCl) 2 g
丙二酸鈉(sodium malonate) 3 g
葡萄糖(glucose) 0.25 g
溴瑞香草藍(bromthymol blue) 0.025 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後，分取3 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.7±0.2。
2.8 檢液之調製(註2)
以無菌操作稱取檢體25 g，置於無菌鐵胃袋或已滅菌均質杯內。加BHI培養液225 mL，均質2分鐘。將已均質化之檢體混合液供作檢液。
註2：處理含油脂量多、不易勻散及易起泡沫之檢體時，應加入適量已滅菌之乳化劑(如Tween 80，使其於檢液中濃度為1 %)，並充分振搖，使之乳化。
2.9 增菌培養
將2.8節之檢液於室溫振盪培養10分鐘，再靜置10分鐘使檢體自然沉澱，取上層BHI培養液於另外已滅菌之容器，於35℃培養3小時，使細胞復甦(resuscitation)。移入等量之雙倍濃度之TP培養液，於44±0.2℃培養20小時。
2.10 分離培養
增菌培養之2.9節TP培養液鉤取一種環菌量，分別在L-EMB及馬康奇培養基表面劃線後，於35℃培養20小時，觀察所形成菌落之生長狀態，若為可疑致病性大腸桿菌者，菌落中央呈暗紫色，扁平，帶有或不帶金屬光澤，在馬康奇培養基上之菌落為紅色、無色、或淡粉紅色，挑取至少5個可疑菌落接種於血液基礎培養基，於35℃培養24±2小時，供作革蘭氏染色、生化試驗及血清型別試驗用。
2.11 鑑定試驗
2.11.1 革蘭氏染色(Gram stain)：
(1) 加適量0.85%生理食鹽水於載玻片上，以接種針(或環)鉤取適量菌株，均勻塗抹成薄抹片，風乾後迅速通過火焰3～4次微熱固定，勿直接火烤。
(2) 初染：將已固定之抹片，用哈克氏結晶紫液染1分鐘，水洗。
(3) 媒染：加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。
(4) 脫色：用95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再水洗，此步驟僅約30秒，惟視抹片之厚薄而定。
(5) 複染：用哈克氏複染液複染30秒，水洗。
(6) 風乾。
(7) 鏡檢：呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏陰性菌。結果為革蘭氏染色陰性，無芽胞桿菌者，則為可疑致病性大腸桿菌。
2.11.2 生化試驗：自2.10節之血液基礎培養基鉤菌，作以下試驗。
2.11.2.1 初步試驗
2.11.2.1.1 硫化氫產生試驗(H2S production test)：鉤菌利用斜面劃線及穿刺法接種方法，TSI斜面培養基，於35℃培養20±2小時，培養基呈黑色者為正反應，否則為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.1.2 尿素酶試驗(Urease test)：鉤菌接種於尿素培養液，於35℃培養20±2小時，培養液由橘紅色變為紫紅色者為正反應，仍維持橘紅色者為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.1.3 阿拉伯糖發酵試驗(Arabinose fermentation test)：鉤菌接種於阿拉伯糖溴甲酚紫培養液，於35℃培養20±2小時，培養液由紫色變為黃色者為正反應，否則為負反應，致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.1.4 吲哚試驗(Indole test)：鉤菌接種於胰化蛋白腖培養液，於35℃培養24±2小時，加入柯瓦克氏試劑0.2 mL，輕輕搖動後靜置10分鐘，上層呈現紅色，則為正反應；否則為負反應，致病性大腸桿菌通常為正反應，經上述試驗確認為可疑致病性大腸桿菌時，始繼續進行以下試驗。
2.11.2.1.5 鄰硝苯基吡喃半乳糖試驗(ONPG test)：自2.11.2.1.1節之可疑致病性大腸桿菌反應之TSI培養基斜面上鉤菌，置於含有0.85%生理食鹽水0.2 mL之試管，作成懸浮液後，再加入一片浸過鄰硝苯基吡喃半乳糖試劑之濾紙小圓片，輕輕搖動後，於35℃培養6小時，濾紙小圓片變成黃色者為正反應，否則為負反應，致病性大腸桿菌為正反應。
經鄰硝苯基吡喃半乳糖試驗確認為可疑致病性大腸桿菌時，始繼續進行以下試驗。
2.11.2.2 第二步試驗(註3)
2.11.2.2.1 核糖醇發酵試驗(Adonitol fermentation test)：鉤菌接種於核糖醇溴甲酚紫培養液，於35℃培養48小時，培養液由紫色變為黃色者為正反應，否則為負反應，大部分致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.2 氰化鉀試驗(KCN test)：鉤菌接種於氯化鉀培養液後以橡皮塞封緊試驗管口，於35℃培養48±2小時，每隔24小時觀察一次，培養液由清澈狀變為混濁狀者為正反應，仍維持清澈狀者為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.3 離胺酸脫羧酶試驗(Lysine decarboxylase test)：鉤菌接種於離胺酸脫羧酶培養液，徐徐注入液態石蠟至高約2.5 cm，於35℃培養96 ± 2小時，每隔24小時觀察一次。培養液維持原紫色者為正反應，由紫色變為黃色者為負反應，大部分致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.4 歐普氏試驗(VP test)：鉤菌接種於MR-VP培養液，於35℃培養48±2小時，取培養液1 mL至另一已滅菌之試管，加入歐普氏試劑之溶液A 0.6 mL及溶液B 0.2 mL後，再加入少許肌酸，振搖均勻，經2～4小時後觀察結果，呈現粉紅色則為正反應，否則為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.5 纖維雙糖發酵試驗(Cellobiose fermentation test)：鉤菌接種於纖維雙糖溴甲酚紫培養液，於35℃培養48±2小時，培養液由紫色變為黃色者為正反應，否則為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.6 檸檬酸鹽利用試驗(Citrate utilization test)：鉤菌接種於柯塞爾氏檸檬酸鹽培養液，於35℃培養72～96小時，呈現混濁狀，則為正反應；仍維持原澄清狀則為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.7 乳糖發酵試驗(Lactose fermentation test)：鉤菌接種於乳糖溴甲酚紫培養液，於35℃培養48±2小時，產生氣體者，則為正反應；未產生氣體者，則為負反應，致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.8 丙二酸鹽試驗(Malonate test)：鉤菌接種於丙二酸鹽培養液，於35℃培養48±2小時，每隔24小時觀察一次。培養液由綠色變為藍色者為正反應；仍維持綠色者為負反應，大部分致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.9 甘露糖醇發酵試驗(Mannitol fermentation test)：鉤菌接種於甘露糖醇溴甲酚紫培養液，於35℃培養48±2小時，顏色由紫色變為黃色，且有氣體產生者為正反應；否則為負反應，大部分致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.10 葡萄糖發酵試驗(Glucose fermentation test)：鉤菌接種於葡萄糖溴甲酚紫培養液，於35℃培養48±2小時，顏色由紫色變為黃色，且有氣體產生者為正反應；否則為負反應，大部分致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.11 甲基紅試驗(MR test)：將2.11.2.2.4節剩餘之MR-VP培養液再培養48±2小時，加入甲基紅指示劑0.3 ml，輕輕搖勻，仍為紅色，則為正反應；否則為負反應，致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.12 醋酸鹽氧化試驗(Acetate oxidation test)：鉤菌接種於醋酸鹽培養基斜面上，於35℃培養48±2小時，每隔24小時觀察一次；斜面上有菌體生長且培養基由綠色變為藍色者為正反應；否則為負反應，大部分致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.13 黏液酸鹽利用試驗(Mucate utilization test)：鉤菌分別接種於黏液酸鹽培養液及黏液酸鹽對照培養液，於35℃培養48±2小時，每隔24小時觀察一次。黏液酸鹽培養液由藍色變為黃色，而黏液酸鹽對照培養液仍維持藍色者為正反應；否則為負反應，大部分致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.14 氧化酶試驗(Oxidase test)：鉤菌接種(避免使用鎳鉻製品)於血液基礎培養基，於35℃培養24±2小時，鉤取菌落後塗抹於滴有氧化酶試劑濾紙上，10～15秒後變為深藍紫色者為正反應；否則為負反應，致病性大腸桿菌為負反應。
2.11.2.2.15 硝酸鹽還原試驗(Nitrate reduction test)：鉤菌接種於吲哚亞硝酸鹽培養基，於35℃培養18～24小時，取培養液3 mL至另一已滅菌之試管，加入亞硝酸鹽試驗試劑A及試劑B各2滴，輕輕搖勻後觀察結果，呈現紅紫色則為正反應，若顏色無變化時加入少許鋅粉而有紅紫色呈現時則為負反應，否則亦為正反應。致病性大腸桿菌為正反應。
2.11.2.2.16 山梨糖醇發酵試驗(Sorbitol fermentation test)：鉤菌接種於山梨糖醇溴甲酚紫培養液，於35℃培養48±2小時，培養液由紫色變為
黃色者為正反應；否則為負反應，大部分致病性大腸桿菌為正反應。
註3：對於部分致病性大腸桿菌類似Shigella不產氣、無運動性、乳糖發酵較慢者，在離胺酸脫羧酶試驗、醋酸鹽氧化試驗、粘液酸鹽利用試驗中，其中一次或一次以上為正反應。
2.11.3 血清型別試驗：經革蘭氏染色及生化試驗確認為可疑致病性大腸桿菌陽性時，自2.11.2節鉤菌接種於血液基礎培養基，於35℃培養24小時，鉤取約3～5倍火柴棒頭之菌量，懸浮於0.85%生理食鹽水3 mL，於100℃加熱1小時或121°C加熱15分鐘，以900 ×g離心20分鐘，去除上清液，再以0.85%生理食鹽水0.5 mL懸浮菌體，取菌液備用。利用蠟筆在載玻片上畫成兩部分，大小約1 × 2 cm，於一部分滴入多價本體抗血清1滴，混合均勻，再於另一部分加入0.85%生理食鹽水30 μL，作為對照組。各吸取懸浮菌液5～10
μL，分別滴入載玻片上之兩部分內，混合均勻，反覆前後傾斜搖動1分鐘後觀察結果。正反應者有凝集現象，負反應者及對照組則為無凝集現象，致病性大腸桿菌為正反應。致病性大腸桿菌多價本體抗血清試驗呈正反應時，續以單價本體抗血清重複上述步驟進行確認。
註4：血清型別試驗可參考使用經確效認可之市售套組，並依其產品說明進行檢測。
2.12 判定：致病性大腸桿菌陽性者，應符合下表所列之結果。
備註：如使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或鑑定系統，其檢驗結果有爭議時，以本檢驗方法為準。