1. 適用範圍：本檢驗方法適用於寵物食品中衣索金 (Ethoxyquin)、丁羥甲苯(Butylated hydroxytoluene, BHT) 及丁羥甲醚(Butylated hydroxyanisole, BHA)等3品項抗氧化劑之檢驗。
2. 檢驗方法：檢體經萃取及淨化後，以高效液相層析儀(high erformance liquid chromatograph, HPLC) 分析之方法。
2.1裝置：
2.1.1 高效液相層析儀：
2.1.1.1 檢出器：光二極體陣列檢出器(photodiode array detector)。
2.1.1.2 層析管：Poroshell 120 EC-C18，2.7 μm，內徑3 mm × 15 cm，或同級品。
2.1.2高速分散裝置(High speed dispersing device)：SPEX SamplePrep 2010 GenoGrinder®，1000 rpm以上，或同級品。
2.1.3 離心機(Centrifuge)：可達5000 ×g以上。
2.2試藥：乙腈均採用液相層析級； 醋酸採用試藥特級；檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、無水硫酸鎂及氯化鈉均採用分析級；去離子水(比電阻於25℃可達18 MΩ∙cm以上)；衣索金 (Ethoxyquin)、丁羥甲苯(Butylated hydroxytoluene, BHT) 及丁羥甲醚(Butylated hydroxyanisole, BHA)對照用標準品共3品項。
2.3 器具及材料：
2.3.1 離心管：50 mL，PP材質。
2.3.2 容量瓶：10 mL，褐色。
2.3.3 濾膜：孔徑0.22 μm，PVDF材質。
2.3.4 陶瓷均質石(Ceramic homogenizer)(註1)：採用Bond ElutQuEChERS P/N 5982-9313，或同級品。
2.3.5 萃取用粉劑(註)：含檸檬酸鈉1 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g、無水硫酸鎂4g及氯化鈉1 g。
註1：陶瓷均質石可視檢體狀況自行評估使用。
註2：可依需求自行評估使用市售萃取用組合套組。
2.4 移動相溶液之調製：
2.4.1 移動相溶液A(5%醋酸溶液)：
取醋酸50 mL，加去離子水使成1000 mL，以濾膜過濾，取濾液供作移動相溶液A。
2.4.2 移動相溶液B：乙腈。
2.5 標準溶液之配製：
精確量取衣索金 (Ethoxyquin)、丁羥甲苯(Butylated hydroxytoluene, BHT) 及丁羥甲醚(Butylated hydroxyanisole, BHA)對照用標準品各10 mg，以乙腈溶液稀釋並定容至10 mL，作為標準原液，於-18℃避光貯存。臨用時取適量標準原液，以乙腈溶液稀釋至100 ug/mL，供作標準溶液。
2.6 檢液之調製：
取檢體1.00 g，精確稱定，置於離心管中，加入陶瓷均質石1顆、去離子水8 mL及乙腈10 mL，再加入萃取用粉劑，蓋上離心管蓋，隨即激烈振盪數次，防止鹽類結塊，再以高速分散裝置於1000 rpm 振盪或以手激烈振盪1分鐘後，以5000 × g 離心5分鐘。取上清液以濾膜過濾後，供作檢液(註)。
註：檢液調製後，應儘快進行儀器分析。
2.7 鑑別試驗及含量測定：
精確量取檢液及標準溶液各10 μL，分別注入高效液相層析儀中，依下列條件進行液相層析。就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間比較鑑別之，並依下列計算式求出檢體中各抗氧化劑之含量(mg/kg) ：
檢體中各抗氧化劑之含量(mg/Kg) =( C × V)/M
C：由標準曲線求得檢液中各抗氧化劑之濃度(ug/mL)
V：萃取檢體之乙腈體積(10 mL)
M：取樣分析檢體之重量(g)
高效液相層析測定條件(註)：
光二極體陣列檢出器：定量波長280 nm。
層析管：Poroshell 120 EC-C18，2.7 μm，內徑3 mm × 15 cm。
層析管溫度：45℃。
注入量：10 μL。
移動相溶液：A液(5%醋酸溶液)與B液(乙腈)以下列條件進行梯度分析
時間(min) A(%) B(%)
0 → 4 70 30
4 → 15 30 70
15 → 20 30 70
20.1 → 30 70 30
移動相流速：0.7 mL/min。
附註：
1.本檢驗方法之定量極限各抗氧化劑均為10 mg/kg。
2.上述測定條件分析不適時，依所使用之儀器，設定適合之測定條件。
3.以液相層析串聯質譜儀(LC/MS/MS)進行確認時，其LC/MS/MS之多重反應偵測(multiple reaction monitoring, MRM)模式參考參數如表一，且其相對離子強度(定性離子與定量離子之波峰面積比)應符合下列容許範圍：
相對離子強度(%) 容許範圍(%)
＞ 50 ± 20
＞20 ~ 50 ± 25
＞10 ~ 20 ± 30
≤ 10 ± 50
4.以氣相層析質譜儀(GC/MS)進行確認時，其GC/MS之選擇離子偵測(selectedion monitoring, SIM)模式之偵測離子如表二，且其相對離子強度(定性離子與定量離子之波峰面積比)應符合下列容許範圍：
相對離子強度(%) 容許範圍(%)
＞ 50 ± 10
＞20 ~ 50 ± 15
＞10 ~ 20 ± 20
≤ 10 ± 50
5.若有干擾需以LC/MS/MS或GC/MS進行定量時，應先進行方法確效。
6.檢體中有影響檢驗結果之物質時，應自行探討。